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Siete pasos para obtener imágenes de biología celular de alta calidad

Juan Carlos Gallego-Gomez. carlos.gallego@udea.edu.co Facultad de medicina Universidad de Antioquia

Paso 1

Monte las células de sus experimentos en cristales cubre-objetos dentro de placas multipozos.

Paso 2

Lave las células con Tampón de Preservación¹ y luego con el Tampón de Fijación².

1. Solución isotónica con el medio intracelular tanto en los electrolitos, como pH y osmolaridad.

2. Solución de paraformaldehído preparada en el tampón anterior, que produce una fijación en las condiciones más parecidas a las que estaban las células naturalmente*.
* Orozco-García, E., Trujillo-Correa, A., & Gallego-Gómez, J. C. (2016). Cell Biology of Virus Infection. The Role of Cytoskeletal Dynamics Integrity in the Effectiveness of Dengue Virus.

Paso 3

Permeabilizar³ y bloquear⁴ con soluciones adecuadas.

1.Solución isotónica con el medio intracelular tanto en los electrolitos, como pH y osmolaridad.

2.Solución de paraformaldehído preparada en el tampón anterior, que produce una fijación en las condiciones más parecidas a las que estaban las células naturalmente*.
* Orozco-García, E., Trujillo-Correa, A., & Gallego-Gómez, J. C. (2016). Cell Biology of Virus Infection. The Role of Cytoskeletal Dynamics Integrity in the Effectiveness of Dengue Virus.

Paso 4

Marcaje con anticuerpos primarios.

El marcaje con los anticuerpos primarios de- penderá de la pregunta de investigación, en lo cual casi que no hay limitaciones, puesto que se tienen anticuerpos comerciales disponibles para casi cualquier proteína celular.

Paso 5

Detección con anticuerpos secundarios y fluoróforos.

La detección dependerá del marcaje primario y las necesidades del investigador Para el caso de esta imagen, hemos revelado la proteína del virus, usando un anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo, que emite fotones en verde (Alexa- fluor-488).

Los microfilamentos de actina fueron revelados, usando Phalloidin conjugada a Alexa-fluor-594, que fluoresce en rojo. Y el núcleo se detectó con Hoechst, que fluoresce en el espectro azul.

Paso 6

Observación y captura de las imágenes mas representativas.

La observación y captura de las imágenes en el Microscopio Avanzado de Fluorescencia o en el Confocal de Disco Giratorio (imagen arriba), varían de acuerdo a las necesidades

La mayoría de estudios sobre distribución subcelular de una o varias proteínas, pueden hacerse con alta calidad en el Microscopio de Fluorescencia, como en la siguiente imagen.

Paso 7

Editar y cuantificar los hallazgos más importantes de las imágenes para publicar.

La edición de las imágenes es un proceso esencial, donde se escogen los aspectos más importantes de los hallazgos (ROI. Region of Interest), que tendrán que ser cuantificados en pixeles.

Las fotos de ambos microscopios arrojan una serie de parámetros cuantitativos, que son claves para obtener las representaciones más objetivas de lo observado.

Las cuantificaciones dirigidas a aspectos específicos del fenómeno en estudio, serán clasificadas para ser sometidas al proceso de cuantificación.